北冬虫夏草水提物对人肺腺癌细胞A549的作用

北冬虫夏草水提物对人肺腺癌细胞A549的作用

颜晶晶¹，唐永范²，陆巍杰²，张鑫²，孙加源¹，韩宝惠¹

（1.上海交通大学附属胸科医院肺内科，上海200030；

2.上海国宝企业发展中心，上海200001)

 【摘要】目的 探讨北冬虫夏草水提物(CME)对人肺腺癌细胞A549的作用。方法 以不同质量浓度的CME 处理A549 细胞24、48、72 h，CCK8 法检测细胞生长抑制率。以0.5 mg /mL CME 处理A549细胞(干预组) 12、24和48 h，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率，Western blotting检测A549细胞增殖相关蛋白(p-ERK 和p-Akt)和凋亡相关蛋白(caspase-3)的表达，以未予CME处理的A549细胞作为对照组。结果 A549细胞生长抑制率随CME质量浓度的升高和处理时间的延长而上升，呈明显的浓度－时间依赖性(P＜0.01) 。与对照组比较，干预组G₂ /M 期细胞比例明显增加( P＜0.01)；干预组细胞凋亡率显著高于对照组(P＜0.01)，且与CME 处理时间呈显著正相关( r=0.995，P＜0.01)；干预组p-ERK和p-Akt表达明显低于对照组，且与CME 处理时间呈显著负相关( r =－0.881，P＜0.01；r =－0.932，P＜0.01)；干预组 caspase-3 表达显著高于对照组( P＜0.05)，且与CME 处理时间呈显著正相关( r=0.681，P＜0.01)。结论 CME 对A549 细胞生长的抑制作用可能与其使细胞阻滞于G₂ /M 期并诱导细胞凋亡有关；CME 有望成为肺腺癌辅助治疗药物。

       肺癌是威胁人类健康的主要疾病，已成为世界范围内引起肿瘤患者死亡的重要原因，占新发肿瘤病例的14.5%，居各类肿瘤死亡病例的首位，男性占29%，女性占26%。根据肺癌的不同分期，手术、放疗及全身化疗是治疗肺癌的主要手段，而中草药辅助治疗手段因其不良反应少、依从性好而在肺癌治疗领域占主要地位，其中冬虫夏草是一种珍贵中药材，现代医学研究表明其具有调节免疫、降血糖、抗氧化及抗肿瘤等功效。近年来，因国内外需求增加，冬虫夏草供不应求，价格猛涨，急需开辟新药源。“北冬虫夏草”( Cordyceps militaris) 也称蛹草、蛹虫草或北冬虫夏草，与冬虫夏草同属，所含各种化学成分和冬虫夏草含量基本一致，同样具有重要的药用价值。本研究经体外实验观察北冬虫夏草水提物( Cordyceps militaris extract，CME) 在抑制人肺腺癌细胞A549生长及诱导其凋亡方面的作用，为其临床应用提供理论依据。

       CME经高压液相色谱仪鉴定含有蛋白质、虫草素、虫草多糖、腺苷及多种微量元素，其中的有效成分虫草素( cordycepin) 为含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤类生物碱，结构明确，具有调节免疫、抗病毒、抗细菌、抗真菌和抗肿瘤的作用。CME因其具有明显的抑制白血病细胞生长及促凋亡作用，已用于各种白血病的治疗，本研究以期通过体外实验进一步证实CME 对肺癌细胞株A549 的生长抑制及诱导凋亡作用。

       本实验中，CME处理A549 细胞后倒置显微镜观察发现细胞有明显变形、皱缩及死亡现象。细胞活力检测实验中，CME分别处理A549细胞24、48和72 h 后，细胞的生长增殖受到明显抑制，呈浓度－时间依赖性，但在相同质量浓度CME 处理48 h 与72 h的细胞生长抑制率比较差异无统计学意义，这也是在之后的凋亡率检测中采用不同时点( 12、24 和48 h) 观察的原因。实验观察到0.5 mg /mL CME 作用细胞24 h，与其他各质量浓度组的细胞生长抑制率比较差异均有统计学意义，且细胞生长抑制率＜50%，因此选取0.5 mg /mL 质量浓度作为细胞周期和凋亡试验的作用浓度。本实验结果显示：CME可以阻滞A549 细胞于G₂ /M 期，从而抑制了细胞的进一步分裂增殖；同时，CME作用下的细胞凋亡率随着作用的时间延长而呈升高趋势，且明显高于对照组，说明CME 具有诱导A549 细胞凋亡的作用，但本研究不足的是未经免疫荧光实验证实CME 处理后凋亡细胞的特征。

       细胞的分裂增殖信号通路通过调控多种增殖相关信号蛋白发挥作用。在细胞内的增殖信号转导途径中最重要的就是丝裂原活化蛋白激酶( mitogenactivated protein kinase，MAPK) 通路和磷酸肌醇－3激酶/蛋白激酶B ( phosphoinositide 3-kinase /protein kinase B，PI3K/Akt) 通路。ERK 是MAPK 的重要成员，而Akt 是PI3K 经多种生长因子活化后的下游靶点，两者与肿瘤的发生和发展及转移等密切相关。已经证实PI3K/Akt 途径的相关基因整体表达水平与非小细胞肺癌之间具有明显的相关性。ERK 和Akt 均经磷酸化后激活了数量众多的蛋白，包括转录因子、细胞骨架蛋白、激酶及其他酶，进而发挥调节细胞的分裂增殖及调控细胞周期的作用。本实验中，经CME 处理的肺腺癌细胞A549 中p-ERK及p-Akt蛋白均呈低表达，说明CME 的抑制作用干扰了MAPK 和PI3K/Akt 通路中的ERK 及Akt 磷酸化水平，从而实现对肿瘤细胞生长的抑制作用，并且阻滞细胞周期于G₂ /M 期，这与之前报道的虫草素抑制人宫颈癌细胞株Hela 及人口腔上皮鳞状细胞OEC-M1及结肠癌细胞HCT116 周期于G₂/M 期的结论一致。

      在细胞凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶家族( caspase)引发的级联反应是中心环节，其激活主要包括线粒体依赖途径和死亡受体介导的信号转导途径，激活下游的效应caspase，其中caspase-3 在凋亡过程中起着关键作用，然后通过切割特异性底物，导致细胞凋亡。有研究结果显示：CME 通过提高caspase-3的活性起到促白血细胞HL-60 凋亡作用。本实验观察到，经CME 作用的A549 细胞caspase-3 相对表达增加，活力明显增强，说明其具有明显诱导细胞凋亡的作用。有研究结果显示：P-Akt 表达下降也可通过激活下游凋亡因子，使caspase-3 表达增加。CME 通过caspases 作用及改变线粒体膜的通透性来促进乳腺癌细胞MDA-MB-231 凋亡。水提物引起的凋亡与Akt 失活有关，并且符合时间依赖性，此诱导凋亡作用可被LY294002-PI3K/Akt 的抑制剂所消除，说明水提物诱导的凋亡与caspase-3 活性增强和Akt 失活有关。因此，我们认为CME 通过抑制ERK及Akt 磷酸化水平，在北冬虫夏草促细胞凋亡过程中可能发挥一定的作用，本研究并未采取2条信号通路的阻断剂阻断信号通路后观察分析凋亡是否受到影响，因此CME 经何种凋亡途径实现这种作用尚有很大的研究空间。

       由此可见，CME 具有抑制肺腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡作用，为临床应用北冬虫夏草制剂作为抗肺癌治疗的辅助手段提供了有利的证据，但有关CME的抗肺癌机制仍需进一步的体内试验加以证实。

（摘自：《上海交通大学学报》（医学版）2011年第31卷第7期：922-926）