虫草素对结肠癌细胞体外增殖、迁移能力的影响及其诱导细胞凋亡的作用

虫草素对结肠癌细胞体外增殖、迁移能力的影响及其诱导细胞凋亡的作用

蔡 伟¹ 叶 青¹　唐 亮²　余伯成²　郑民华¹

(1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海200025；

2. 上海国宝企业发展中心，上海200001）

【摘要】 目的 研究虫草素在体外对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响，及其诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法　按血清药理学实验原则，将20只BALB/c裸鼠随机分为两组，分别喂饲虫草素或生理盐水，3d后处死取血清，将血清按下列不同处理方法在体外与人结肠癌细胞株SW1116共培养：(1)虫草素组；(2)化疗组；(3)虫草素＋化疗组（下称：联合用药组）；(4)空白对照组（下称：对照组）。以CCK-8法检测细胞增殖抑制作用，Transwell小室观察检测细胞迁移能力，荧光染色和流式细胞检测法观察细胞凋亡情况。结果  (1) SW1116细胞经虫草素＋顺铂联合作用96h、120h后，细胞增殖的抑制率显著高于其余三组（P＝0.02）；(2)虫草素联合顺铂能显著减少肿瘤细胞迁移数（P<0.05）；(3)经Hoechst33258荧光染色，在联合用药组中见大量被染成亮蓝色的凋亡细胞，流式细胞仪定量分析显示该组细胞凋亡率明显高于其余三组（P<0.05）。结论 虫草素及铂类化疗药（顺铂）对人结肠癌细胞株SW1116有显著抑增殖、抗迁移和促凋亡作用，虫草素与顺铂合用可显著提高这一疗效，提示虫草素有一定的化疗辅助作用。

虫草素（Cordycepin）是北冬虫夏草中最主要的生理活性成分。传统医学认为：冬虫夏草性平味甘，入肺、肾二经，“肺与大肠相表里”。研究显示北冬虫夏草具有提高免疫力和抗肿瘤的作用。但是冬虫夏草的主要有效成分虫草素是否同样具有预防和治疗结肠癌的作用及其作用机制引起广泛关注。本研究运用血清药理学的方法，给BALB/C裸鼠分别喂饲虫草素或同体积生理盐水后处死取血清，将各组血清分别或联合顺铂在体外与人结肠癌细胞株SW1116共培养，研究虫草素对结肠癌细胞的增殖、迁移能力的影响，及其诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

一、用“血清药理学方法”研究虫草素抗结肠癌细胞的意义

近年来，结肠恶性肿瘤的发病率与死亡率呈上升趋势，欧美国家结直肠癌的发病率位列恶性肿瘤的第二位，在我国为第四位。据2005年上海统计，结直肠癌的发病率已高居恶性肿瘤的第二位。

       手术仍是目前治疗结直肠肿瘤的主要手段。但近30年来疗效提高并不显著。由于大部分结直肠恶性肿瘤患者在临床确诊时已伴有腹膜转移或其他重要脏器的微转移，单靠扩大切除范围难以改善预后。临床常采用术后辅助化疗为主的综合治疗方案，间或加用物理治疗、靶向药物和中药，但中晚期患者的术后无瘤生存率和总生存率仍不令人满意。约有50％的患者死于术后肿瘤的复发和转移。因此，有必要探寻新型辅助药物以提高结直肠癌疗效，改善预后。

       冬虫夏草是我国的珍稀药材，其具有提高免疫力和抗肿瘤的作用。现代医学研究显示：冬虫夏草中最主要的生理活性成分为虫草素和虫草多糖（CP）。有研究显示CP可以通过激活宿主免疫反应而发挥抗肿瘤作用。另有研究显示虫草素和CP能够促进人扁桃体及小鼠T-淋巴细胞的增殖，并且能够促进环磷酰胺（CY）抑制鼠脾活化T细胞增殖；在一定浓度下，可以显著升高人扁桃体活化T细胞TNF-β的分泌水平，这对增强机体抗肿瘤免疫功能具有很大的作用。但目前文献报道的体外实验大多将虫草素或CP直接作用于离体细胞，这与临床实际用药以及药物实际作用情况明显不符。一般在临床上患者口服用药后，药物需经消化道吸收、经血液运送到全身各部、再经机体代谢和排泄，因此对肿瘤起治疗作用的成分不一定是药物的原形，它可以是经代谢后的其他产物，也可以是药物在体内经过许多中间环节引导机体产生的其他药理反应，为此我们根据血清药理学的原则设计了本实验：先给裸鼠喂饲虫草素，让药物经消化道进入机体，通过一定的代谢过程，使血液富含药物有效成分，然后提取其血清，在体外将含药血清和（或）联合铂类化疗药物作用于结肠癌SW 1116细胞，借以间接观察虫草素对肿瘤细胞增殖、迁移的影响及其诱导细胞凋亡的作用。如此设计似较直接加药法更符合临床实际，更为合理。

      “血清药理学”的概念和基本原理最早在1988年由日本学者田代真一提出，用于改进以前的不太合理的体外药理实验方法。事实上体外实验是药理的实验研究中不可或缺的手段。其优点是条件可控性强，可在细胞、亚细胞水平进行超微、生化、受体、基因等方面的研究，揭示药物机制较为深入，重复性好，使用材料少。但随着研究的深入，某些药物直接加入离体反应体系进行体外实验的研究方法存在很多问题。由于某些药物化学成分复杂，口服后体内要进行一系列的生物转化以发挥药效，而且理化性质复杂，经常造成一些假阴性和假阳性的结果，例如：20世纪50、60年代国内外用肿瘤细胞株在体外过筛数千种植物提取物，报道了上百个阳性结果，但用于体内实验结果大部分为阴性。这促使各国学者不断努力，寻找更好的方法。1984年，在日本召开的第一届和汉医药学会上，日本学者首次提出给动物灌服药物一定时间后，取其血清进行实验的药理学新方法。1988年田代真一正式提出了“血清药理学”这一新概念。此后，血清药理学广泛应用于肿瘤、心血管、消化、免疫等方面的药理学研究中，并与体外实验所见作比较，取得了很大的进展。为此本研究应用血清药理学方法，进行虫草素抗结肠癌的体外实验。

二、虫草素对结肠癌细胞抑增殖、抗迁移和促凋亡的作用

      人结肠癌细胞具有增殖快、易于向周围组织浸润及经淋巴道早期转移的特点，这是结肠癌导致患者死亡的重要原因。肿瘤细胞的迁移是造成肿瘤转移的重要因素。有效地抑制肿瘤细胞增殖、减少细胞迁移，可以减少肿瘤转移的发生率。本研究通过CCK-8细胞增殖抑制实验发现，虫草素组血清在作用于结肠癌细胞株SW1116 24h后出现显著抑制细胞增殖的作用，但对细胞增殖的抑制作用不如传统化疗药物顺铂明显。虫草素与顺铂联合使用24～72 h，其对细胞增殖抑制作用与单纯使用顺铂时相同，但当96h后，联合用药组对细胞增殖的作用明显强于单纯化疗组（P＝0.02）。提示早期、足量和长期应用虫草素能有效地抑制结肠癌细胞的增殖，这与黄浩等的研究一致。虫草素不能替代顺铂。但虫草素在长期应用后有明显的辅助化疗的作用。

       Transwell小室法测定细胞迁移的实验显示，虫草素能有效减少肿瘤细胞迁移的发生。虫草素联合顺铂后减少迁移发生的作用更为明显，相比单纯应用顺铂组差异有统计学意义（P＜0.05）。说明虫草素能减少肿瘤细胞迁移的发生，联合人体正常组织器官中，细胞的凋亡与增殖保持动态平衡，一旦平衡被打破，将导致细胞的恶性转化和肿瘤的发生。因此，诱导肿瘤细胞发生凋亡，有利于预防肿瘤的发生和转移。本研究通过Hoechst 33258荧光染色定性研究，在虫草素组中见到大量凋亡细胞，在联合用药组中似乎凋亡细胞数量更多。采用流式细胞仪法定量检测细胞凋亡率，结果发现联合用药组细胞凋亡率显著高于其他三组（P＜0.05），说明虫草素联合化疗药物有较强的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。这可能是其抑制肿瘤结节增大的原因之一。

       运用血清药理学方法进行体外实验，结果显示，虫草素能有效抑制结肠癌细胞株 SW1116的增殖、并有诱导肿瘤细胞凋亡和抗迁移的作用；虫草素联合顺铂使以上的抑增殖、抗迁移和促凋亡作用更为明显。

（摘自：《中华临床医师杂志》2011年第5卷第14期：4048-4054）