不同剂量虫草活力素对大鼠支气管哮喘模型慢性气道炎症的作用机制研究

不同剂量虫草活力素对大鼠支气管哮喘模型慢性气道炎症的作用机制研究

张 旻¹  周 新¹  唐 亮²  余伯成²  李 群¹  张国清¹

（1. 上海交通大学附属第一人民医院呼吸科，上海200080；

2. 上海国宝企业发展中心，上海200001）

【摘要】 目的 对不同剂量虫草活力素(简称虫草) 在大鼠支气管哮喘(简称哮喘) 模型慢性气道炎症中的抑制作用及相关机制进行初步探讨。方法 Wister 大鼠，随机分为对照组、 单纯模型组、 虫草20 mg/ kg、 50 mg/kg 组、布地奈德( BUD) 组及 BUD 联合虫草素干预组。卵蛋白致敏建立大鼠哮喘模型后给予药物干预 8 周，对各组支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 进行细胞分类计数及观察肺组织的病理变化，同时应用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清和 BALF 的哮喘相关细胞因子水平。结果 与单纯模型组比较，虫草两种剂量治疗组均降低慢性哮喘大鼠 BALF 的细胞总数和嗜酸粒细胞数，差异有统计学意义( P < 0. 05)，并呈剂量相关性；HE 染色显示大剂量虫草、BUD治疗组及联合用药组较单纯模型组炎症细胞浸润、平滑肌肥厚及黏膜肺组织水肿等炎症表现明显减轻；较单纯模型组，虫草治疗组血清及 BALF 的白介素 4(IL-4)、 IL-14 水平下降，干扰素γ升高，差异有统计学意义( P < 0. 05)，并呈剂量相关性。结论 一定剂量的虫草可通过上调T辅助细胞1( Th1)相关细胞因子，下调Th2 相关细胞因子，减少嗜酸粒细胞等炎症细胞渗出，抑制哮喘的慢性气道炎症，并与糖皮质激素具有协同作用。

      支气管哮喘( 简称哮喘) 作为一种常见呼吸系统慢性疾病，可累及不同年龄组的人群, 病程长达数十年。其发病率在世界范围内持续上升，未来 15~ 20 年内，全球哮喘患者将由目前的3亿达到4亿，并引发严重的疾病相关经济负担。近年研究表明哮喘的发病机制可能为某些环境因素作用于遗传易感个体，通过 T 细胞调控的免疫介质释放机制(细胞因子、炎症介质) 作用于气道产生炎症及气道高反应性；同时气道结构细胞特别是气道上皮细胞与上皮下基质及免疫细胞的相互作用以及气道神经调节的异常均加重了气道高反应性，也直接或间接加重了气道炎症。

       虫草活力素( 简称虫草) 为北冬虫夏草的主要活性成分，北虫草是虫草属的模式种，与冬虫夏草为虫草属的同属异种真菌，两者的化学成分、营养成分和药用功能均非常相似，其主要药用成分虫草素等含量远高于野生冬虫夏草，因此被选为冬虫夏草的最佳替代品而进行大量的人工培育。目前大量药理学研究表明具有耐缺氧、抗炎、调节免疫功能，抗肝纤维化等作用，有研究表明，虫草可通过调节支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 中的细胞含量，降低蛋白酶活性而对于由内毒素引起的小鼠急性肺损伤具有保护作用，并可通过对大鼠肺气肿模型 T 辅助细胞 1( T h1) / T h2 相关细胞因子平衡的纠偏作用改善气道慢性炎症，但虫草在哮喘动物模型气道炎症中的作用目前国内外尚缺乏系统性研究的报道。本研究旨在通过观察慢性炎症相关性指标的变化，对虫草在慢性哮喘的气道炎症反应中干预作用及靶位进行初步探索，从而对其潜在的抗炎疗效提供实验依据。

       哮喘是由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、气道上皮细胞和树突状细胞等多种炎症细胞和细胞组分共同参与的气道慢性炎症疾病。目前认为 Th1/ T h2 失衡即 Th2 细胞介导可能是其最初发生的机制之一。Th1细胞因子包括IFN-γ 、IL-2 等, INF-γ可通过激活 IL-17F干扰素诱导蛋白-10 信号通路、T 盒转录因子蛋白、一氧化氮途径以及下调嗜酸粒细胞趋化因子受体等途径在抑制哮喘炎症反应中发挥作用。而Th2细胞产生 IL-4、IL-5和 IL-13等细胞因子, 其中IL-4和IL-13能诱导B细胞成熟和分化以及合成和释放与哮喘病情的严重程度、气道炎症以及气道高反应性的持续存在密切相关抗原特异性免疫球蛋白E, Th2细胞通过酪氨酸系统的JAK家族而被磷酸化, 进而启动特异性基因的表达和转录, 包括嗜酸粒细胞趋化蛋白、IL-4 及IL-13 等, 并形成正反馈和炎症级联效应, 共同导致气道炎症的发生和发展; IL-5能促进嗜酸粒细胞增殖、成熟、活化并募集至气道黏膜, 成熟的嗜酸粒细胞有密集的细胞内颗粒, 包括主要碱基蛋白和可刺激肥大细胞释放组胺的嗜酸粒细胞阳离子蛋白等, 因此本研究选择BALF细胞总数、各型细胞数分类以及 T h1 相关因子 IFN-γ和 T h2 相关因子 IL-4 及 IL-13作为哮喘慢性炎症的量化观察指标, 同时结合形态学观察。

       虫草活力素的主要药效成分为虫草素, 即 3’ -脱氧腺苷, 它对核因子κB活性、丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶和P38 磷酸化的抑制实现抗炎作用已在 Kim 等对脂多糖诱导的炎症实验中证实。由于维持Th1/ Th2 平衡安全有效的药物无疑是目前控制哮喘慢性炎症的持续和发展的潜在靶点, 因此本研究将此药作为主要干预药物, 但鉴于其在哮喘领域尚无相关研究, 故本研究在设立不同剂量治疗组的同时, 建立迄今抑制哮喘炎症的最主要的治疗药物-糖皮质激素治疗组以及联合治疗组, 以观察其量效关系且有无协同作用。

      本研究显示两种剂量虫草治疗组较单纯模型组均能显著抑制 BALF中嗜酸粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及巨噬细胞的渗出, 其中 50 mg/ kg 剂量组对嗜酸粒细胞的抑制要显著优于 20 mg/ kg 组, 提示存在量效性。同时, 50 mg/ kg 剂量组虽对各细胞数在数值上高于BUD组, 但差异无统计学意义, 而其显著低于联合用药, 则提示两药可能存在协同性。有研究表明腺苷在炎症反应中的调节作用通过隶属G-蛋白耦联受体超家族的腺苷受体(AR)介导, 已知有 A1AR、 A2aAR、A2bAR、A3AR 4种亚型, 在支气管肺组织中均有分布。抗原吸入可降低哮喘患者痰液和血清中 AR 的表达, 其中 A2aAR 活化可抑制多种炎性细胞的聚集和炎症介质的释放, 因此推测虫草对于炎症细胞的疗效可能与腺苷A2aAR受体相关。

       我们发现不论在血清和 BALF, 对IL-4、IL-13和 IFN-γ水平, 虫草素均表现出一定的量效性, 但对于全身的炎症抑制作用优于局部炎症抑制作用, 且联合用药除对血清IL-4的抑制显著优于BUD治疗组, 在其他细胞因子的干预作用无治疗优势。较 BUD, 虫草素对于上调 Th1 相关细胞因子的干预作用更明显, 但结合形态学观察, 预示 Th1 上调对于哮喘慢性炎症的保护作用有限, 虽然近年研究大部分研究支持 Th1 相关炎症因子可通过抑制 Th2 作用缓解哮喘的慢性气道炎症炎症, 但哮喘动物模型中引入Th1细胞后加重气道炎症的实验表明其对于肺部病理性免疫有促进作用, 因此对于哮喘慢性炎症, Th1/ Th2 比值与哮喘慢性炎症相关性有待进一步研究。

       总之, 本实验表明达到一定治疗剂量的虫草可通过全身和局部上调 Th1 相关细胞因子, 下调Th2相关细胞因子, 减少嗜酸粒细胞、中性粒细胞渗出抑制哮喘慢性炎症, Th2 相关细胞因子的下调可能较Th1相关细胞因子的上调在慢性炎症的抑制作用更明显。研究结果虽提示虫草单独用药对于炎症细胞和炎症因子的抑制作用低于糖皮质激素, 但联合用药具有潜在的协同作用。

(摘自: 《国际呼吸杂志》2010年8月第30卷第15期：897-901)